【摘要】1997年8月发现首例人禽流感病例以来,不断有人禽流感病例发生,截至2007年3月1日,WHO报道的经实验室确证的H5N1禽流感感染者共277例,死亡167例,死亡率超过50%。目前WHO对禽流感的预警是3级,即是一种新的流感亚型,已经在人类中引起严重疾病,但还没有在人类中持续传播流行。本文就目前H5N1禽流感病毒来源,跨越物种传播的机制,致病力决定因素及人间传播能力等几个关键的基础问题研究进展进行综述。
一. H5N1病毒来源研究
A型流感病毒的自然宿主是水禽,鸟类之间多通过直接或间接接触粪便污染的气溶胶、水、食物而传播,可以为无症状感染,轻微病变和严重的全身致死性疾病,多为无症状感染,其中H5和H7可引起高致病性禽流感。偶尔病毒可以发生变异或重组穿过物种屏障,感染其他动物,如人类或家禽。系统进化树结果表明1918年的H1N1流感病毒可能是通过变异直接由禽类传给人类,而1957年和1968年的流感毒株都是禽流感毒株和当时流行的人流感毒株的重组体,1957年的亚洲流感毒株为H2N2。从感染野鸭的禽流感毒株获得三个基因(H2、N2、PB1)和当时的人流感流行毒株H1N1重组,同样地,引起1968年香港流感的H3N2毒株是感染鸭的病毒株H3、PB1基因和当时流行的人流感H2N2重组。
基因组分析结果表明1997年引起香港人和禽流感爆发的H5N1毒株HA基因来源于1996年从广东省的鹅身上分离的H5N1毒株(Gs/Gd ),但是其复制酶基因和A/鹌鹑/香港/G1/97 (H9N2)及A/鸭/香港/W312/97 (H6N1 )高度同源。Robert G. Webster等人的研究表明鹌鹑对Gs/Gd易感性很高,并且H6N1和H9N2病毒持续在鹌鹑中传播,因此认为鹌鹑是H5N1/97毒株的来源宿主。H5N1病毒对鸡、火鸡、鹌鹑等都是高致病性的,但是家鸭却可以无症状感染并长期排毒,对于H5N1的产生流行意义重大,而野鸟对病毒在亚洲地区的传播起重要作用。
二.H5N1病毒跨越物种传播的机制研究
从1997年首例人禽流感病例发生以来,一个令人担忧的问题就是H5N1病毒能否通过突变或和人流感病毒基因整合获得有效感染人类的能力而引发一场新的高致病性流感爆发。禽与人流感病毒不易在宿主间相互传播,因为禽与人流感病毒在受体特异性方面存在着明显的差别,HA基因226位和228位氨基酸与受体特异性和宿主范围有关。禽流感病毒HA蛋白含有Gln226和Gly228位点,形成一个较狭窄的受体结合袋易于通过α-2,3半乳糖键与唾液酸结合,而人流感毒株一般含有Leu226和Ser228,形成一个较宽的受体结合袋易于通过α-2,6半乳糖键与唾液酸结合。高分辨结构表明1918年的HA具有禽类较狭窄的受体结合袋(Gln226和Gly228),但仍能通过α-2,6半乳糖键和唾液酸结合,原因是1918年H1N1流感病毒在保持Gln226和Gly228化学特性不变的情况下,仅通过其HA 190Asp→Glu的突变,引起结构的细微变化,变得易于和人体细胞受体结合,实现了从鸟类到人类的跨物种传播。这一变异不仅使得病毒能够在人群中传播,而且由于病毒保留了禽流感病毒氨基酸特征,与人体免疫系统所熟悉的其他流感病毒不同,结果人体免疫系统无法对其进行有效识别和抵御,最终造成大流行。同样的,如果H5N1病毒HA 190位Asp也突变为Glu,也能使它易于和人类唾液酸受体结合,从而引起人间流感大流行。序列分析表明1968年流行的H3N2毒株在由禽传给人的过程中HA有6个碱基发生了变化,包括在226位Gln→Leu突变,这些变化可能正是适应新宿主的原因,因为它们改变了HA受体结合袋周围的位点。H2N2和H3N2流行株都有禽类来源的PB1基因,这一基因可能在跨越物种传播的过程中有重要作用。近来的研究也证实多聚酶和禽流感病毒感染哺乳动物细胞有关,PB2的701Asn及714Arg和NP的319Lys能提高多聚酶的活性,说明多聚酶基因突变对病毒在新宿主的适应能力非常重要。老虎的分离株在PB2 627位出现了Lys,这一突变能显著增强多聚酶的活性,和病毒适应哺乳动物宿主有关。也发现人类呼吸道上皮的纤毛细胞含有α-2,3型唾液酸,所以H5N1病毒跨越物种传播的机制是多因素的,病毒和机体受体的特异性结合是关键步骤,同时多聚酶位点的突变增加其在哺乳动物细胞内的活性,利于其有效复制,对于跨越物种传播有重要意义。
三.H5N1病毒致病力研究
近年来H5N1病毒进化的结果是毒力越来越强,宿主范围越来越宽,除了家禽野鸟也包括哺乳动物,1999~2002年间从中国鸭身上分离的H5N1病毒对老鼠致病力越来越强,1999年和2000年分离的毒株致病力弱于2001和2002年分离毒株。流感病毒细胞表面的HA、NA、多聚酶复合体(PB1、PB2、PA)和非结构蛋白(NS)和致病力有很大关系。HA裂解位点的结构是影响裂解难易的主要因素之一,位点插入多个碱性氨基酸,附近糖基化位点的缺失等,均能使HA对蛋白水解酶的敏感性增强,从而使病毒致病性提高。高致病性流感的HA蛋白通常在裂解位点含有多个碱性氨基酸,能被宿主细胞多种酶所识别,这样病毒就能引起整个肺的感染甚至全身的感染,是病毒毒力的一个主要因素。H5N1的HA裂解位点的氨基酸由PQ-RETR转变为PQRKRKTR或PQRERRRKKRGLF可增加对蛋白酶的敏感性,从而增加了病毒的致病性同时也增加了人类的易感性。但是1918年的HA裂解位点没有插入多个碱性氨基酸,而它本身的NA蛋白和HA的裂解有关,其中的机制还不清楚,因此低致病性流感病毒不但能通过HA的突变增强毒力并且能通过NA的突变增强毒力。另外一个高致病性的标志是病毒能向没有胰蛋白酶的组织扩散,低致病性的流感病毒一般局限在表达胰蛋白酶的上呼吸道。1918年西班牙流感病毒和H5N1病毒都可以不通过胰蛋白酶激活HA蛋白,对老鼠都是高致病性。更重要的是,H1N1感染的症状如出血性肺炎,由高表达的巨嗜细胞来源的细胞因子和化学因子引起的高烧等临床表现和近来H5N1的体内和体外试验观察结果一致,两种病毒的相似性引起研究者的关注。
Elena A. Govorkova等人研究了04年分离的4株人源和9株禽源H5N1禽流感病毒对雪貂的致病力,尽管所有毒株的HA裂解位点都插入多个碱性氨基酸序列,但是不同毒株的毒力不同,说明其他基因位点的差异对高致病性也很重要。Diane J.Hulse等人发现HA基因的97、108、126、138、212和217位点和裂解位点的多个碱性氨基酸序列共同影响病毒毒力,同时发现NA蛋白头部附加的糖基化位点也是高致病力的一个影响因素。某些HA裂解位点插入多个碱性氨基酸的毒株致病性不一定高,说明毒力是多个位点的联合作用而不是单个位点决定的。NS蛋白192位Asp→Glu的替换在体外能增加抵抗干扰素和肿瘤坏死因子-α干扰作用的能力,增加在猪体内的复制能力。G.Gabriel等人研究了多聚酶突变对病毒毒力的影响,结果表明PB2蛋白Asn701和Arg714,NP蛋白Lys319能提高多聚酶的活性,提高对宿主的致病力,PB2蛋白627位Glu→Lys的变异提高了H5N1病毒的致病力。1918年的流感毒株和随后的人流感病毒多聚酶基因和鸟类毒株的多聚酶基因共有10个氨基酸的改变(PB2 199Ala→Ser、PB2 475Leu→Met、PB2 567Asp→Asn、PB2 627Glu→Lys、PB1375Asn/Thr→Ser、PA 55Asp→Asn、PA 100Val→Ala、PA 382Glu→Asp、PA 552Thr→Ser)值得注意的是在目前流行的H5N1毒株中也发现了其中的一些变异,说明这些变异有利于病毒在人类细胞的复制,能增强致病力。1997 H5N1不同毒株对老鼠的毒力不同,但在雪貂身上毒力没有表现出相同的不同,相同的毒株对不同动物的致病力不同,说明致病力不仅和病毒本身有关,并且宿主因素也很重要,要结合病毒和机体两方面因素来研究病毒的致病力。
四.H5N1病毒人传人?
H5N1禽流感能否在人间大范围爆发取决于病毒能否在人与人之间有效传播。目前的人禽流感病例多有病死禽接触史,但是也有偶发的人传人的报道。Thijs Kuiken发现健康的猫密切接触感染H5N1病毒的猫能感染H5N1病毒,并能通过呼吸道和消化道排出病毒。说明H5N1病毒能在哺乳动物间传播。
香港的一项研究表明暴露于病禽或屠宰鸟类可能会出现H5血清学阳性。2004年禽流感爆发期间日本四个屠宰病鸟的工人和越南两个照看受感染老虎的饲养员H5N1血清学阳性。在北越南病人家属中检测到H5N1病毒RNA,但没有感染症状,说明可能存在无症状感染者。越南14岁女性患者没有和禽类直接接触的病史,只是在患病之前照顾她患H5N1的哥哥,哥哥分离毒株和妹妹的分离毒株的NA基因完全相同,只在HA基因271位核苷酸出现了变异。感染的先后顺序,女孩没有病禽接触史,说明病毒可能由哥哥传给了妹妹。在泰国患禽流感的小女孩可能把H5N1禽流感病毒传染给了他的母亲和婶子。越南30%的病人没有病禽接触史,说明可能存在人与人之间的感染。但是目前即使人与人之间的传播发生了,那么传播链也在感染第二个病人之后停止。
H5N1病毒目前已具备了传染病发生流行的三个条件中的两个,即出现了新的病毒,病毒能在人体内复制引起严重的疾病,如果病毒再获得了第三个条件-人传人的能力,将引起流感大流行,另外流感病毒能在症状出现前传播,并且患病起初几天传染性很高,可以在空气中迅速传播,而SARS冠状病毒在症状出现前不会传染,并且在患病7~8天后传染能力才比较强,通常在近距离接触后才会被传染,所以一旦禽流感变异为普通人类流感传播开来,其蔓延速度将远远超过非典。尽管禽流感病毒还未能在人间广泛传播,但是随着人禽流感病例的增多,病毒获得人间传播能力的可能性逐渐增大。
五.结论
感染的鸟类是人感染H5N1的原始来源,目前人传人的情况还比较有限,但是如果病毒继续重组变异,情况可能就会改变,还要继续检测病毒对人群适应能力的变化。搞清流感病毒的变异规律、分子流行病学特征、致病机理、病毒选择物种及跨越物种而流行的分子机制等基础问题,对研制有效的流感疫苗和药物对预防和控制新型流感的爆发是非常重要的。
